Evaluation de l'effet potentiel de perturbation endocrine des pesticides à l'aide de cellules cancereuses bioluminescentes.
L'utilisation courante de pesticides suscite de plus en plus d'interrogations en termes d'impact sur l'environnement mais également sur la santé humaine. Ces composés développés dans l'industrie agrochimique dans le dessein de protéger les cultures nourricières des insectes ou mauvaises herbes peuvent avoir des effets dramatiques en santé humaine animale ou pour l'environnement. Ces molécules présentent parfois des caractéristiques de bioaccumulation et/ou peuvent être transformées en métabolites (produits de transformation) toxiques et/ou rémanents. Certains de ces produits peuvent interférer avec les systèmes endocriniens des vertébrés. Afin de déterminer le niveau de dangerosité des différents pesticides et d'évaluer leurs effets de perturbation endocrine, nous avons établi dans notre laboratoire de nouveaux outils de surveillance. Ces outils sont des lignées cellulaires qui deviennent bioluminescentes en présence de pesticides potentiellement perturbateurs endocriniens.
Effets potentiels de perturbation endocrine des pesticides sur l'homme ainsi que sur les autres espèces animales.
Certaines pathologies humaines et /ou animales pourraient êtres provoqués par des perturbateurs endocriniens présents dans l'environnement. Les perturbateurs endocriniens sont des substances chimiques d'origine naturelle ou artificielle (pesticide ou autre produit) qui peuvent interférer avec la synthèse, le stockage, le transport, le métabolisme, la fixation, l'action ou l'élimination des hormones naturelles. L'exposition, le stockage dans l'organisme à des étapes critiques de la vie sont des données importantes pour estimer les effets adverses d'un perturbateur endocrinien. Ceux-ci peuvent être réversibles ou irréversibles, immédiats ou latents et n'être mis en évidence qu'à certaines étapes clés de la vie. Le mécanisme d'action de ces perturbateurs endocriniens le plus fréquent est la liaison aux récepteurs des hormones. Ces récepteurs sont des protéines actives dans le noyau des cellules qui, pour nombre d'entre elles, transmettent à celles-ci des signaux hormonaux spécifiques conduisant à la modulation de l'expression de gènes cibles.. Les pesticides qui vont se lier à ces récepteurs nucléaires sont susceptibles de modifier le fonctionnement d'une partie du système endocrinien et de provoquer des conséquences sur la reproduction et le comportement. De plus, ils peuvent être des agents stimulateurs et promoteurs de cancers hormono-dépendants. Les effets peuvent également se manifester sur la descendance de sujet exposés.
Des récepteurs nucléaires cibles de certains pesticides sont par exemple les récepteurs des hormones féminisantes (récepteur alpha et béta des oestrogènes). Les œstrogènes jouent un rôle majeur dans la croissance, la différentiation sexuelle et le maintien de l'homeostasie (equilibre harmonieux des facteurs vitaux) dans de bonnes conditions des organes reproducteurs mâles et femelles mais aussi au niveau des os, du foie et du système cardiovasculaire. La liaison à ces récepteurs de pesticides peut avoir pour conséquence d'altérer le processus physiologique de différentiation sexuelle ainsi que de provoquer des cancers des organes sexuels.
D'autres récepteurs nucléaires cibles des pesticides sont par exemple les récepteurs des hormones masculinisantes (androgènes). Les androgènes jouent un rôle majeur dans la différentiation sexuelle mâle et certains pesticides pourraient altérer le processus physiologique de différentiation sexuelle mâle.
Certains pesticides sont également des activateurs du récepteur aux prégnanes. Ce récepteur est impliqué dans les voies de détoxication de l'organisme. Il régule l'expression d'enzymes responsables du métabolisme des hormones stéroïdiennes et thyroïdiennes ainsi que des enzymes impliquées dans la conjugaison et le transport des métabolites polaires de ces hormones. Ce récepteur nucléaire a également un rôle de protection du système endocrinien. Cependant l'activation anormale de ce récepteur pourrait conduire à une diminution du taux d'hormones naturelles (androgènes et œstrogènes) et/ou à la formation de métabolites polaires de molécules environnementales à plus forte activité de perturbation endocrine que les molécules parentales.
Le récepteur nucléaire PPAR gamma (pour Peroxisome Proliferator Activated Receptor gamma) est également une cible de certains perturbateurs endocriniens. Ce récepteur est fortement exprimé dans les adipocytes (cellules accumulant de la graisse) . Il est impliqué dans le contrôle du stockage des lipides et joue un rôle important dans l'induction de l'adipogénèse. Des pesticides qui se lieraient à ce récepteur pourraient agir en tant "qu'obésogènes" et perturber le contrôle de la prolifération et de la différentiation adipocytaire et l'homéostasie lipidique ou glucidique.
Enfin certains pesticides perturbent l'action d'une enzyme (l'aromatase) qui transforme un androgène (la testostérone) en un œstrogène (l'oestradiol).
Il est ainsi évident que les pesticides par leur action au niveau des récepteurs nucléaires (récepteurs des oestrogènes, des androgènes, des prégnanes et PPAR gamma ainsi que d'enzymes impliqués dans la synthèse hormonale (aromatase) peuvent perturber les fonctions endocrines d'un organisme.
Création de lignées cellulaires cancéreuses bioluminescentes.
Afin de mesurer l'effet des différents pesticides sur les récepteurs nucléaires, nous avons créé des lignées cellulaires bioluminescentes. Pour cela, nous avons modifié génétiquement des cellules d'origine cancéreuse de façon à ce qu'elles produisent dans certaines conditions (lorsque le récepteur nucléaire est activé) une enzyme, la luciférase de luciole. La présence de cette enzyme est ensuite détectée en ajoutant son substrat, la luciférine. Nous avons créé différentes lignées cellulaires. La lignée cellulaire MELN (Fig 1) est sensible aux oestrogènes. En présence d'oestrogènes, la cellule synthétise de la luciférase que l'on peut mesurer en rajoutant dans le milieu de culture de la luciférine (le substrat de l'enzyme). Nous avons également créé des lignées cellulaires qui répondent aux androgènes, aux prégnanes, ainsi qu'aux ligands de PPAR gamma .Ces différentes lignées cellulaires nous permettent de déterminer si un pesticide est un activateur d'un récepteur nucléaire. Dans la lignée appropriée, l'exposition au pesticide conduira à une augmentation de la synthèse de luciférase. Ces cellules nous permettent également d'identifier des inhibiteurs. En présence d'un activateur connu (testostérone pour le récepteur des androgènes par exemple), ces cellules nous permettent de déterminer si un pesticide est un inhibiteur de ce récepteur. Le signal lumineux sera plus faible en présence de pesticide et testostérone qu'en présence de testostérone seulement. Ces tests cellulaires sont beaucoup plus rapides que la plupart des autres tests existants et peuvent être automatisés permettant ainsi l'étude d'un grand nombre de composés ou d'un grand nombre de récepteurs nucléaires. Nous utilisons actuellement ces tests pour mesurer les activités d'échantillons environnementaux comme les eaux et leurs matières en suspension, les sédiments ou les boues de rivières et de stations d'épuration. Contrairement à l'analyse chimique, cette méthode permet de mesurer l'activité d'un échantillon (donc la présence de tout composé actif) et non pas la présence d'un seul composé. Ainsi ces outils sont très utiles pour détecter la contamination d'un échantillon mais également pour mesurer l'abattement de son activité lors d'un traitement comme celui d'une station d'épuration.
Profil d'action des pesticides sur les récepteurs nucléaires
Les lignées cellulaires que nous avons établies nous ont permis de caractériser les effets des pesticides sur différents récepteurs nucléaires. Si plusieurs pesticides sont actifs, les doses auxquelles ils ont un effet est souvent très élevé (de l'ordre du milligramme par litre). Ces concentrations sont généralement supérieures à celles que l'on peut mesurer généralement dans les échantillons environnementaux. Elles correspondent plutôt à celles auxquelles les ouvriers agricoles peuvent être exposés. Cependant certains pesticides pourraient avoir des effets sur plusieurs voies de perturbation endocrine. Dans ce cas, les effets ne seraient pas uniquement additifs mais pourraient être synergiques.
Dans le tableau 1 sont représentés nos résultats les plus significatifs. Le métabolite M2 de la vinclozoline, le DDT sont des activateurs des récepteurs des oestrogènes alpha et béta et des inhibiteurs du le récepteur des androgènes. Ces deux composés ont ainsi une action synergique en ayant une action féminisante (par le biais des récepteurs des oestrogènes) et anti-masculinisante (par le biais du récepteur des androgènes). D'autres pesticides comme le méthoxychlore et le chlordécone (képone) ont une action différente sur deux récepteurs des oestrogènes. Ils ont un effet activateur sur le récepteur alpha ( ??) des oestrogènes qui est impliqué dans le processus de cancérogénèse et un effet inhibiteur sur le récepteur des oestrogènes béta qui pourrait avoir un effet protecteur. Enfin des trialkylétains dont le tributylétain connu pour ses effets masculinisants sur les mollusques qui pourrait être du à une inhibition de l'aromatase, sont aussi des activateurs du récepteur nucléaire PPAR gamma.
Conclusion.
Bien que les effets adverses des pesticides sur la santé humaine ont été démontrés clairement après une forte exposition comme ce fut le cas pour des agriculteurs utilisant le DDT ou des ouvriers fabriquant le chlordécone, les résultats sont beaucoup moins tranchés lors d'une exposition chronique à faible dose. Peu d'études ont pu établir une relation directe entre les concentrations en pesticides dans l'environnement et les effets sur la santé humaine. Cependant, le fait que ces composés puissent agir à différents niveaux (récepteurs nucléaires ou enzymes comme l'aromatase) leur confère un rôle potentiel de perturbateur endocrinien dû à une action synergique sur les diverses cibles.
Dr Patrick Balaguer. INSERM Montpellier
